Biofilm – Dr. Jekyll anebo Mr. Hyde ?

Na první pohled ryze odborná problematika tzv. biofilmu není tématem pouze pro odborníky, jak by se mohlo zdát. Bez ohledu na věk či pohlaví se s ním v praxi setkáváme dnes a denně. První studie zabývající se biofilmy se objevily již před asi 30 lety.

V současnosti je pozornost zaměřena zejména na odstranění problémů s biofilmy, které se v této souvislosti vyskytují – v lékařství jde především o endokarditidu (zánětlivé onemocněním srdečních chlopní a vnitřní výstelky srdce) a cystickou fibrózu. Cystická fibróza je nejčastějším dědičným smrtelným onemocněním bělochů, s incidencí asi 1 na 2500 živě narozených dětí. Těsně před 2. světovou válkou umíralo na cystickou fibrózu asi 70 % postižených dětí v prvním roce života. K jejím projevům patří opakované infekce dýchacích cest, neprospívání, vysoký obsah solí v potu. Velké procento dospělých mužů s cystickou fibrózou (98) je neplodných. V průmyslu jde o odstranění problémů spojených s biofilmy v čističkách odpadních vod, ale zároveň paradoxně i v úpravnách pitné vody. Téma tedy stojí rozhodně za pozornost. I když na něj dohlédneme jen díky optice mikroskopů.

O co jde?

Mikrobiální organismy, zejména bakterie, mají tendenci shlukovat se do složitých útvarů pokrývajících tenkou vrstvou jejich tělíček rozsáhlé povrchy. Tyto shluky se nazývají biofilmem. Ve formě biofilmu obsahujícího milióny bakterií jsou bakterie více odolné před účinky antibiotik a způsobují celou řadu problémů lidskému imunitnímu systému. Biofilmy jsou tak dokonce příčinou celé řady závažných chronických onemocnění jako je cystická fibróza nebo periodontitida (zánětlivé onemocnění vaziva mezi kořenem zubu a stěnou zubního lůžka). Zároveň mají za následek nejrůznější průmyslové kontaminace, dále tzv. biofouling (vznik povlaků bakterií na površích ponořených do nejrůznějších tekutin včetně vody) a biokorozi, která je problémem například i ve zdivu Karlova mostu v Praze.

Hodné a zlé

Bakterie v biofilmech mohou být ale využity i ku prospěchu člověka. Mohou například za velkou část samočisticí schopnosti potoků a řek, umějí snižovat znečištění půd a dokonce i produkovat elektřinu bez souběžné produkce dnes nepopulárního CO2.

Úplně klasickým biofilmem je například zubní plak – vrstvička bakterií pokrývající během krátké doby zubní sklovinu. Větší problém než biofilm na povrchu zubů způsobující přinejhorším jen vznik zubního kazu je pronikání infekcí do lidského těla. Zdrojem infekcí bývají nejčastěji cévky – ať již arteriální, žilní, anebo i močové. Povrch cévek bývá i při nejlepší snaze o čistotu v krátké době pokryt povlakem z bakterií odolných vůči běžně používaným čistícím detergentům i antibiotikům. Podobně infekci do těla mohou vnášet dýchací přístroje, děložní tělíska, dialyzační přístroje, do oka dokonce i nesprávně udržované kontaktní čočky. Biofilmem se často pokrývají i různá cizorodá tělíska v těle, mezi které dnes bohužel patří i kloubní náhrady a jiné implantáty.

Zvláštností biofilmů, důležitou pro jejich úspěšný rozvoj v lidském těle, je zejména o několik řádů vyšší rezistence k desinficiencím a antibiotikům. K té dochází patrně díky omezené difúzi těchto látek v prostředí hustě nahlučených bakteriálních buněk, sorpce basických antibiotik, pomalý růst bakterií nacházejících se v centrálních částech biofilmů (zapřičiňuje pomalý metabolismus a následně i jen pomalé vstřebávání antibiotik bakteriemi) a schopnost dlouhodobého hladovění. Další neméně důležitou zvláštností biofilmu je o tři řády vyšší frekvence přenosu genů mezi jednotlivými buňkami. Znamená to, že pokud jedna bakterie získá rezistenci proti určitému antibiotiku (v přírodě docela běžný jev), tisíckrát pravděpodobněji ji bude schopna předat i okolním buňkám biofilmu v porovnání s těmi, které se pohybují volně bez výraznější vazby na své okolí.

Jak se na to přišlo?

Jak jsme si již přečetli, o existenci bakterií se ví již docela dlouho. Rovněž přes sto let je známa metoda kultivace bakterií v tekutinách, nejčastěji v tzv. bujónu, kde se bakterie volně vznášely, plavaly a množily se, ale bylo obtížné je od sebe oddělit. Jen o pár let později objevil Robert Koch metodu kultivace bakterií na pevných půdách – nejčastěji na agaru, přírodním polysacharidu s vysokou gelující schopností, který se vyrábí z červených mořských řas rodu Floridae. Na povrchu těchto půd tvoří bakterie malé kopečky – kolonie – které je schopna založit i jedna jediná bakteriální buňka (na rozdíl od člověka se bakterie množí vesměs nepohlavně, pouhým dělením). Bakterie byly následně hodnoceny podle svého tvaru, barvy, metabolismu... To však byla naprosto dokonalá past.

Dlouhá léta platilo dogma, že bakterie kultivované na agarových plotnách nemohou žít například v žaludku člověka či jiných savců neboť je tam velmi kyselé prostředí, případně se nemohou množit uvnitř buněk jiných organismů, anebo že nemohou růst a množit se v prostředí chudém na živiny. Ale ouha, v našich žaludcích žijí desítky druhů bakterií. Uvnitř buněk organismů se množí rovněž desítky druhů mikroorganismů jako například legionelly v amébách. A v prostředí s absencí některých klíčových živin se bakterie rovněž množit mohou, protože během krátké doby jsou schopny vytvořit mutace, které danou nedostatkovou živinu ke svému růstu nepotřebují. A tak dnes již známe bakterie (legionelly) z rezavé vody naplňující ústřední topení, známe bakterie (Thermophilus aquaticus), které žijí v prostředí gejzírů horkých až 80 °C v americkém Yellowstonu, anebo dokonce archeální rod Halobacter a jemu příbuzné žijící v podmořských „černých kuřácích“, což jsou průduchy na dně oceánů bez ustání chrlící obrovské objemy mineralizované mořské vody o teplotě vyšší než 400 °C, která vlivem vysokého tlaku okolní vody nevře (průduchy bývají v hloubce několika tisíc metrů pod hladinou).

A v čem že spočívá náš problém? Pokud žijí jednotlivé bakteriální buňky samostatně, často podobná extrémní prostředí nepřežijí, případně se alespoň nemnoží. Bakterie však často mají přirozenou tendenci přilnout, doslova se přilepit na pevný povrch. A právě tímto přilnutím se začíná tvořit biofilm způsobující zvýšenou odolnost bakterií.

Tloušťka biofilmu závisí na dostupnosti živin a na tom, zda je složen z jednoho či více bakteriálních druhů. Častější je přítomnost více druhů najednou, naopak v prostředí chemicky ovlivněném občas expanduje jen jeden druh, který se stihl nejrychleji přizpůsobit. Naměřené hodnoty tloušťky biofilmu kolísají od několika téměř do stovky mikrometrů. Biofilm není homogenní, skládá se z agregátů a četných dutin. Jsou to spletité, vzájemně propojené kanálky rozmanitého tvaru. Důležitá je i koncentrace rozpuštěných plynů v těchto kanálcích, zejména pak kyslíku důležitého pro společnou existenci bakterií aerobních (vyžadujících kyslík) a anaerobních (žijících bez kyslíku). Koncentrace kyslíku na povrchu biofilmu je nízká, o trochu hlouběji stoupá a dále do hloubky podle očekávání klesá, takže na původním povrchu je vesměs nulová. V různých vrstvách má biofilm navíc různý elektrický náboj, což pomáhá transportu živin.

Jak biofilm vzniká?

Hladovějící plovoucí bakteriální buňky začnou na svém povrchu vystavovat molekuly zvané adhesiny. Tyto adhesiny mají za následek přichycení se bakterií na pevný povrch, který může (ale samozřejmě také nemusí) skýtat dostatečný přísun živin. Jakmile bakterie k povrchu přilnou, změní své chování i vzhled. Začnou produkovat do prostředí velké množství lepivých polysacharidů, jehož hmotnost může být až stokrát větší než hmotnost bakterie, která jej produkuje. A právě tyto polysacharidy přispívají k „přilepení“ dalších bakterií. Buňky pak drží pohromadě v jakési hlenovité mikrokolonii, rostou, množí se a v kolonii vznikají následně i struktury zajišťující dostatečnou výživu, přísun čerstvé vody a případně i kyslíku pomocí nejrůznějších kanálů. Pokud velikost kolonie či tloušťka biofilmu přesáhne kritickou mez, některé buňky se začnou odlučovat, opět odplouvají a kolonizují další části přilehlých povrchů.

Přítomnost sousedních buněk bakterie zjišťují pomocí chemických signálů, které jednotlivé buňky vydávají, a které omezují nadměrný růst bakterií v místech kde je jich již nadbytek. Signálními látkami jsou jednoduché molekuly složené z aminokyseliny serinu a mastné kyseliny, někdy též samotné peptidy (tj. krátké molekuly složené z několika aminokyselin). Pokud geny řídící syntézu signálních látek zmutujeme, vytvářejí bakterie jen jakýsi tenký nediferencovaný biofilm bez kanálků a dalších složitějších útvarů a jsou mnohem citlivější k detergentům.

Biofilm a lidské tělo

Nejstarším biofilmem popsaným v lidském těle je zubní plak – žlutavý povlak na povrchu zubů. Pozoroval ho už Antoni van Leeuwenhoek. Lze jej sice odstranit běžným čištěním zubů, nicméně během několika hodin se ihned vytváří znovu. Jeho tvorbu zesiluje sacharóza a některé další cukry, které konzumujeme v potravě. Základem je vrstvička slin přítomná na zubech téměř vzápětí po jejich vyčištění. Na této tenké vrstvě obsahující minerální a organické látky se usazují bakterie, z nichž některé mají schopnost vylučovat hlenovité polysacharidy zachytávající další a další bakterie a dokonce i kvasinky. Plak se tak stává silnějším, málo propustným a hladovějící bakterie jsou nuceny štěpit své vlastní zásobní cukry, čímž vznikají kyseliny poškozující zubní sklovinu a umožňují následný vznik zubního kazu.

Velmi častý je rovněž vznik biofilmu v nekrotických tkáních, žlučových cestách, při infekci kostní dřeně, při zánětu prostaty či při cystické fibróze. Masa polysacharidy tvořeného hlenu produkovaná bakteriemi následně ucpává volné prostory. Při cystické fibróze dokonce ucpává dýchací cesty a znesnadňuje výměnu plynů v plicích poté co pseudomonády (Pseudomonas aeruginosa) obsadí plicní cesty a k tvorbě biofilmu využijí i mrtvých bílých krvinek, které původně měly za cíl infekci pseudomonádami zabránit. Nejčastěji tvoří biofilm pseudomonády, stafylokoky, Escherichia coli, některé streptokoky a aktinomycety.
Jak jsme si již řekli v úvodu článku, častá je rovněž přítomnost biofilmů na cévkách zaváděných do arterií, žil, močové trubice, či vzdušnice. Podobně vznikají biofilmy na kloubních protézách a jiných implantátech včetně umělých srdečních chlopní, kde mohou způsobit až jejich uvolnění.

Jsou biofilmy k něčemu dobré?

Ano, biofilmy lze použít k celé řadě aplikací a využít tak pozměněných vlastností a odolnosti bakterií rostoucích ve vrstvičce namísto toho, aby byly kultivovány jako plovoucí v médiu. Typickým příkladem je biofiltr – jedna z několika technologií používajících mikroorganismy k čištění zapáchajícího vzduchu.
Biofiltr ke své činnosti potřebuje ventilátor, přívod vzduchu určeného k přečištění a médium vyživující buňky. Vzduch je nasáván do biofiltru, kde je proháněn živným médiem směrem k biofilmu mikroorganismů a přečištěn opět ven do atmosféry. Dobře udržovaný biofiltr může snížit emise páchnoucích látek a o 85 %, čpavku o 60 % a sirovodíku až o 90%. Efektivitu ovlivňuje zejména čas, který čištěný vzduch stráví ve styku s médiem, a vlhkost čištěného vzduchu. Není nutno používat tekutá média, naopak časté je použití média složeného ze 70 % dřevěných hoblin a 30% kompostu. Kompost zajišťuje výživu bakterií biofilmu, zatímco hobliny zajišťují zvýšení porozity a dostatečnou prostupnost pro proháněný vzduch. Podobný filtr bývá používán i po několik let. Mikroorganismy v tomto systému využívají zapáchající plyny jako potravu – zdroj energie a živin; odpadními produkty pak bývá voda, CO2, minerální soli, některé organické sloučeniny a samozřejmě nové mikroorganismy.

Dalším z mnoha možných využití biofilmů dotažených až do prvních pokusů o uplatnění v praxi je mikrobiální elektrochemický článek (microbial fuel cell – MFC). V principu zde jde o to, že bakterie jsou schopny přesunu elektronů na kovy, které se tak stávají katodou daného elektrického článku. Elektrický článek jako takový je již funkční, pozornost se nyní zaměřuje na vylepšení jeho parametrů – proudu, napětí, spotřeby substrátu (substrátem mohou být např. odpadní vody), omezení růstu biomasy v článku a na rovnoměrnost rozložení biofilmu podél anody. Publikováno již bylo vyvinutí elektrochemických článků spotřebovávajících právě živiny z odpadních vod – anebo naopak zhotovení miniaturních článků, které by mohly být používány jako baterie např. do mobilních telefonů.

Závěrem

Přirozené biofilmy jsou komplexními ekosystémy nesestávajícími se z jednoho druhu baktérie, ale spíše z celé řady mikroorganismů včetně archeí, protozoí, hub a dokonce i malých mnohobuněčných organismů. Porozumění těmto systémům je ještě stále během na dlouhé trati, nicméně první výsledky již naznačují slibná uplatnění získaných poznatků v nejrůznějších předem netušených aplikacích.

---

Trocha historie
O existenci bakterií v přírodě se ví již dlouhou dobu. První hypotézy o existenci mikroorganismů se objevily již ve středověku. Již roku 1020 ve svém Kánonu lékařství perský lékař a filosof Avicenna (Ibn Sína) uvedl hypotézu, že tělní tekutiny jsou kontaminovány nečistými cizími tělísky před tím než dojde k infekci daného člověka, nicméně tato tělíska nepovažoval za hlavní příčinu nemoci. Ve 14. století však arabští lékaři Ibn Khatima a Ibn al-Khatib pod dojmem morové (Yersinia pestis) epidemie v Maury okupované španělské Granadě napsali, že tato infekční choroba byla způsobena nakažlivými entitami, které vstupovaly do lidských těl. Hypotézy a teorie arabských lékařů se v Evropě staly populárními s nástupem renesance, zejména díky spisům Girolama Fracastora.
K dalšímu vývoji v mikrobiologii došlo v 17. století, kdy Antoni van Leeuwenhoek roku 1676 zkonstruoval a použil jednoduchý mikroskop. Nazval jej „animalcules“ a svá pozorování zaslal v sérii dopisů Královské společnosti v Londýně. Název „bakterie“ byl následně zaveden Christianem Gottfriedem Ehrenbergem roku 1828 a je odvozen od řeckého slova βακτήριον (bakterion) znamenajícího v přibližném překladu „drobné osazenstvo“.

V 19. a 20. století šel vývoj již rychle kupředu. Roku 1859 Louis Pasteur poprvé demonstroval, že proces fermentace (kvašení) je způsoben růstem mikroorganismů. Ve stejné době Robert Koch zjistil, že cholera, anthrax a tuberkulóza jsou přenášeny malými choroboplodnými zárodky, za což mu byla následně v roce 1905 udělena Nobelova cena. Roku 1910 bylo Paulem Ehrlichem vyvinuto první antibiotikum – částečně pozměnil barvivo barvící spirochetu Treponema pallidum na chemikálii, která tohoto patogena selektivně zabíjela. A konečně roku 1977 Carl Woese zpracoval první fylogenetický strom bakterií na základě sekvence 16S podjednotky ribozomální RNA a rozdělil prokaryota na dvě evolučně dominantní linie – Archaea a Bacteria.