Kopírka na DNA

Velké množství chorob má své genetické pozadí. Kriminalistům postačuje k určení pachatele úlomek jeho vlasu nebo jen kapka zaschlé krve. Pokud chceme zjistit, zda jsme nositeli toho či onoho genu, případně usvědčit zločince, skutečně stačí nepatrné množství biologického materiálu. Pro určení konkrétní podoby genu je ale potřeba velkého počtu kopií molekul DNA. Jak tedy pracují „kopírky“ DNA?

Když se v laboratoři hledá nějaký gen, musí se nejprve izolovaná DNA namnožit, aby ji mohly přístroje vůbec detekovat. V minulosti byly k tomuto účelu zotročeny bakterie. Jako neúnavní dělníci produkovaly DNA, která do nich byla vkládána. Postup byl však časově náročný a výsledky nebyly pokaždé nejlepší. Až koncem roku 1983 objevil kalifornský biochemik Kary Mullis princip metody nazývané polymerázová řetězová reakce (PCR z anglického Polymerase Chain Reaction). Je to elegantní a jednoduchá technika, která umožňuje „nakopírovat“ si v laboratorních podmínkách požadovaný úsek DNA prakticky v neomezeném množství, přičemž množství původního vzorku může být extrémně malé (teoreticky jediná molekula). Další autoři ji v průběhu doby dovedli až k dnešní dokonalosti, kdy kopírky DNA (PCR cyklery) patří k běžnému vybavení biomolekuláních laboratoří.
Princip kopírování DNA je založen na znalostech jejích fyzikálních a chemických vlastností. Molekula DNA se v buněčném jádře vyskytuje ve formě dvoušroubovice tvořící dvě protichůdná vlákna. Je to analogie s polaritou – jedno směřuje odshora nahoru, druhé naopak. Vzájemně jsou poté spojeny díky velmi slabým chemickým vazbám, tzv. vodíkovým můstkům. Pevnost spojení je ovšem zvýšena jejich počtem, proto je teplota nutná k rozpletení vláken vyšší než 90 °C. Samotná dědičná informace je zakódovaná v pořadí čtyř chemických sloučenin zkracovaných pod písmeny A, C, G, T (adenin, guanin, cytosin, thymin), které jsou součástí kostry DNA.
První krok reakce představuje rozvolnění obou vláken působením zvýšené teploty, při níž právě dojde k vzájemnému oddělení řetězců. Poté je roztok ochlazen na 70–75 °C za současného dodání stavebních jednotek DNA – nukleotidů, které v přesném pořadí nasedají na volné vlákno. Jejich přidružování k mateřské molekule není náhodné. Vždy dvě ze čtyř písmen vytvářejí nerozlučný pár (A–T, C–G). Každý dílek pak vpadne pouze do jednoho ze čtveřice možných míst.
Jako se při stavbě domu cihly neuloží samy, tak i sestavování nové DNA řídí molekulární zedníci. Biologové jim říkají DNA-polymerázy. Jsou to enzymy, které pomáhají při skládání nového řetězce. V naší kopírce musí být přítomni jak tito zedníci, tak stavební materiál (nukleotidy). Běžná DNA-polymeráza se jako každá bílkovina rozpadá už při 50 °C. Proto se do praxe zavedl podobný enzym izolovaný z termofilní bakterie Thermus aquaticus žijící v horkých pramenech. Dostal podle ní jméno Taq-polymeráza.
Polymeráza je ale nadmíru nerozhodná a neumí si vybrat, kde začít stavět. Poslední nezbytnou složkou směsi jsou proto „stoličky“ (blízké příbuzné DNA tzv. RNA), na které enzym při zahájení práce nasedá a začíná stavět. K původní DNA se tedy přidají stavební nukleotidy, zednická polymeráza, RNA-stoličky a hurá do práce !
Celý proces představuje jakoby řetězovou reakci. Již po 35 cyklech dostaneme 68 biliónů identických kopií (viz obrázek). Jelikož jeden cyklus trvá asi 5 minut, lze při automatizaci techniky naklonovat požadovaný úsek DNA během několika hodin.
V praxi PCR technika proniká do všech oblastí molekulární biologie. Díky ní není již limitován výzkum v minulosti těžce získatelné DNA, ani na poli molekulárně biologického výzkumu, ani v diagnostice. Stále nové modifikace a inovace postupů v PCR ji staví do nezastupitelné role v mnoha postupech jako je detekce patogenů, studia virů, ale i běžné denní rutiny při práci s DNA, což může být třeba usvědčení pachatele zločinu nebo vyšetření krve.

Fyzikální okénko
Jak tomu tak bývá, nemají na moderních vynálezech zásluhu jen odborníci jedné oblasti, ale je nutno dát hlavy dohromady. Nejinak tomu bylo také u PCR. Nutnost změn teplot v krátkých časových intervalech o desítky °C (k rozvolnění a spletení šroubovice) je řešen užitím Peltierových článků (mimochodem jsou součástí téměř všech PC). Součástka pracuje na principu obráceného Seebeckova jevu, při němž teplotním rozdílem mezi spoji termočlánku (např. bimetal) vzniká proud. Naopak u bimetalu v PCR se při průchodu proudu prudce zvýší odpor a tím i teplota. V současnosti jsou vyvinuty Peltierovy články již 3. generace s přesností regulace ohřevu až desetiny °C.