Studium specifických genetických variant v jedné buňce

Vědci z jednotky genomové biologie v EMBL (Evropská laboratoř molekulární biologie) vyvinuli vysoce citlivý nástroj, který může pomoci odhalit vazby na komplexní nemoci. Tímto nástrojem je sekvenování jednobuněčné DNA-RNA (SDR-seq). Může studovat DNA i RNA současně uvnitř stejné buňky, což je kriticky důležitý prvek pro pochopení toho, jak genetické varianty ovlivňují genovou expresi v tzv. nekódující oblasti genomu (DNA, která se nepřepisuje v proteiny). Genová exprese je proces, kterým se informace uložená v genu převede na reálnou buněčnou strukturu nebo funkci.

S nástrojem SDR-seq vědci zjistili, že i malé změny v DNA mohou změnit způsob regulace genů v kmenových buňkách a v napadených buňkách u typu rakoviny krve zvané B-buněčný lymfom.   

SDR-seq nabízí genomovým biologům rozsah, přesnost a rychlost k lepšímu porozumění, a tím případně k možnostem léčit širokou škálu nemocí.

Vědci již dlouho uvažovali o souvislosti mezi dědičností a nemocemi. Podezření sahá až k Hippokratovi, který pozoroval a popsal určité nemoci „v rodinách“. V průběhu let díky pokročilé vědě můžeme také porozumět zdroji těchto genetických vazeb v lidském genomu. 

Vědci a spolupracovníci EMBL vyvinuli nástroj, který přesahuje současnou technologii tím, že zachycuje genomové variace a RNA společně v jediné, stejné buňce, čímž zvyšuje přesnost a škálovatelnost ve srovnání s předchozími technologiemi. Mění se tak způsob, jak mohou vědci studovat části DNA, v nichž se s největší pravděpodobností vyskytují variace spojené s nemocí. „Současné metody pro studium DNA a RNA ve stejné buňce mají omezenou propustnost, postrádají citlivost a jsou komplikované“, řekl Dominik Lindenhofer, hlavní autor nového článku o SDR-seq publikovaného v Nature Methods a postdoktorand v EMBL's Steinmetz Group. „Na úrovni jedné buňky jste mohli číst varianty v tisících buněk, ale pouze v případě, že byly exprimovány (prezentovány, vyjádřeny) – tedy pouze z kódovaných oblastí. Náš nástroj funguje, bez ohledu na to, kde se varianty nacházejí, a umožňuje analýzu komplexních vzorků.“

Důležitý rozdíl mezi kódujícími a nekódujícími oblastmi

Genom, který je tvořen DNA, má jak kódující, tak nekódující část. Geny v kódujících oblastech můžeme přirovnat k „receptům“, protože tyto geny se exprimují do RNA, což buňce v podstatě říká, jak vytvářet proteiny, stavební kameny života. 

Nekódující sekce obsahují mnoho regulačních prvků důležitých pro buněčný vývoj a funkci. Více než 95 % variant spojených s onemocněním, které se vyskytují v DNA, jsou v nekódujících oblastech. Až dosud vědci nemohli současně pozorovat DNA a RNA ze stejné buňky ve velkém měřítku, aby určili funkce variant kódu DNA a jejich důsledky.  Víme, že v nekódujícím prostoru existují varianty související např. s vrozenými srdečními chorobami, autismem a schizofrenií, které jsou značně neprozkoumané.

Dešifrování čárových kódů, které sledují jednotlivé buňky

Pro jednobuněčné sekvenování DNA-RNA (SDR-seq) vědci použili k analýze DNA i RNA kapičky emulze olej-voda, přičemž každá kapka obsahovala jednu buňku. Vědci by ve skutečnosti mohli studovat tisíce buněk současně v dané zkumavce a přímo spojovat genetické změny s aktivitou genů. Tento technologický vývoj vyžadoval spolupráci jednotek genomové biologie a strukturální a výpočetní biologie EMBL, lékařské fakulty Stanfordské univerzity a univerzitní nemocnice v Heidelbergu. 

Zpočátku spolupracovníci z výzkumných skupin EMBL Judith Zaugg a Kyung-Min Noh vyvinuli způsob, jak „zafixovat“ buňku, aby se ochránila křehká RNA. Výpočetní biologové z výzkumné skupiny EMBL Olivera Steglea navíc vytvořili přizpůsobený nástroj pro dekonvoluci a dekódování složitého systému čárového kódování DNA potřebného k vybudování této technologie a umožnění další následné analýzy dat. A přestože byl tento dekodér vytvořen speciálně pro tento projekt, vědci očekávají, že jej lze aplikovat i na jiný výzkum.

Výzkumníci z výzkumných skupin Wolfganga Hubera a Sashy Dietricha na EMBL a Universitní klinice v Heidelbergu již dříve prověřovali buňky B-buněčného lymfomu pro jiné výzkumné projekty. Poskytli primární vzorky od pacientů s vysokým počtem genomových variant, aby pomohli nástroj otestovat. Lindenhofer pak použil tyto vzorky k pozorování souvislostí mezi variantami a onemocněním. Zjistil, že rakovinné buňky s více variantami mají zvýšené aktivované signály, které pomáhají rakovině růst.

Čtení DNA a RNA ve stejné jediné buňce umožňuje přesně určit, zda je varianta na jedné nebo obou kopiích genu, a změřit její účinky na genovou expresi ve stejných jednotlivých buňkách. „S buňkami B-buněčného lymfomu jsme byli schopni ukázat, že v závislosti na variantním složení buněk měly buňky různé sklony patřit k odlišným buněčným stavům. Mohli jsme také vidět, že rostoucí varianty v buňce byly ve skutečnosti spojeny s malignějším stavem B-buněčného lymfomu,” říká Lindenhofer.

Nástroj pro sekvenování v jedné buňce skýtá mnoho příležitostí

Nástroj SDR-seq nyní nabízí genomickým biologům přesnost a rychlost, aby mohli lépe porozumět genetickým variantám. I když by nakonec mohl hrát roli při léčbě široké škály komplexních onemocnění, může nejprve pomoci při vývoji lepších screeningových nástrojů pro diagnostiku. „Máme nástroj, který dokáže propojit varianty genů s nemocí“, řekl Lars Steinmetz, hlavní autor článku, vedoucí skupiny EMBL a profesor genetiky na lékařské fakultě Stanfordské univerzity. „Tato schopnost otevírá širokou škálu biologie, kterou nyní můžeme objevit. Pokud dokážeme rozeznat, jak varianty skutečně regulují nemoc a lépe porozumět chorobnému procesu, znamená to, že máme lepší příležitost zasáhnout a léčit jej.”

Zdroj: New tool offers single-cell study of specific genetic variants | EMBL